【佳學(xué)基因檢測】睪丸生殖細(xì)胞腫瘤基因檢測

盡管睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（testicular germ cell tumour, TGCT）總體上較為罕見，但它卻是年輕男性中最常見的惡性腫瘤，其最高發(fā)病率出現(xiàn)在 30–34 歲人群中。TGCT 的兩種主要組織學(xué)類型包括精原細(xì)胞瘤（seminoma）和非精原細(xì)胞性生殖細(xì)胞腫瘤（non-seminomatous germ cell tumour, NSGCT）。NSGCT 通常比精原細(xì)胞瘤更具侵襲性，包括胚胎性癌（embryonal carcinoma, EC）、卵黃囊瘤（yolk sac tumour, YST）、絨毛膜癌（choriocarcinoma）以及畸胎瘤（teratoma）等組織學(xué)亞型；且在單個(gè)病灶中?？梢姸喾N組織學(xué)成分共存。與大多數(shù)其他癌癥不同，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤 很少僅由體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)突變引起，而是源于其原始細(xì)胞——胎兒生殖細(xì)胞——的潛在發(fā)育潛能未被正常控制，最終導(dǎo)致其重新編程。

越來越多證據(jù)表明，癌癥的臨床行為及其治療反應(yīng)反映了其潛在的腫瘤基因組特征。迄今為止，對(duì)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的基因組測序研究大多局限于分析蛋白編碼序列（外顯子組）或基于規(guī)模較小的全基因組測序（WGS）隊(duì)列，因此目前文獻(xiàn)中仍缺乏對(duì) TGCT 整體基因組圖譜的全面描述。值得注意的是，目前已報(bào)道的最大 TGCT WGS 研究僅包含 9 例青春期后（>12 歲）患者。對(duì)于包括結(jié)構(gòu)變異在內(nèi)的關(guān)鍵突變過程及其特征在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表現(xiàn)亦缺乏深入探討，對(duì)生殖細(xì)胞腫瘤演化的理解仍存在巨大空白。

為了推進(jìn)對(duì)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤 的認(rèn)識(shí)，佳學(xué)基因檢測分析了來自英格蘭 7 個(gè) NHS 基因組醫(yī)學(xué)中心、納入英格蘭基因組（GEL）“十萬基因組計(jì)劃”（100kGP）[GEL v12 數(shù)據(jù)版本]的 57 名 TGCT 患者的 60 個(gè)全基因組測序腫瘤樣本。本研究對(duì)成人 TGCT 的基因組景觀、突變機(jī)制及克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)而深入的分析。
 

鑒定亞型特異性的驅(qū)動(dòng)突變

使用 IntOGen 流程（整合了七種互補(bǔ)的驅(qū)動(dòng)基因發(fā)現(xiàn)算法），腫瘤基因解碼在 GEL TGCT 隊(duì)列中搜索潛在的驅(qū)動(dòng)基因。共有八個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)具有顯著的體細(xì)胞突變（KIT、KRAS、NRAS、RAC1、SPEN、EP300、KLF4、KMT2C）。與 TCGA 的 TGCT 研究一致，KIT 驅(qū)動(dòng)突變定義了精原細(xì)胞瘤（seminoma）的一個(gè)亞群（圖 2）。KIT 突變主要集中在第 17 外顯子，其模式與既往在睪丸精原細(xì)胞瘤和顱內(nèi)生殖細(xì)胞瘤中報(bào)道的情況相似。僅在一名臨床 II 期精原細(xì)胞瘤患者中觀察到同一癌基因（KIT）受到多重突變。

進(jìn)一步分析識(shí)別出在精原細(xì)胞瘤亞型中定義不同亞群的額外驅(qū)動(dòng)基因，包括轉(zhuǎn)錄因子 KLF4 和 GTP 酶 RAC1 的功能獲得性突變，以及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶 EP300 的功能喪失性突變（圖 2）。

此外，腫瘤基因解碼使用三種互補(bǔ)算法（OncodriveFML、OncodriveCLUSTL和 ActiveDriverWGS）搜索非編碼區(qū)驅(qū)動(dòng)因素。然而，并未發(fā)現(xiàn)任何處于正選擇壓力下的顯著非編碼元素。

為了補(bǔ)充對(duì) GEL 腫瘤的分析，腫瘤基因解碼重新分析了 TGCT 的 TCGA（128 個(gè)樣本）和 Memorial Sloan Kettering - Metastatic Events and Tropisms（MSK-MET）研究（128 個(gè)樣本）的數(shù)據(jù)，以鑒定更多亞型特異性的編碼驅(qū)動(dòng)突變。在 TCGA 數(shù)據(jù)集中，10 個(gè)基因的體細(xì)胞突變達(dá)到了顯著性，包括 NOTCH1、PIK3CA、BIRC6、ARID1B 和 LRP1B。在 NSGCT 亞型中還鑒定出兩個(gè)候選驅(qū)動(dòng)基因 PTMA 和 FAT4，它們主要呈現(xiàn)功能喪失性突變。GEL 隊(duì)列數(shù)據(jù)也支持 PTMA（prothymosin alpha）作為候選驅(qū)動(dòng)基因的潛在作用，盡管其先前已在 TGCT 中被提示與腫瘤發(fā)生相關(guān)，但當(dāng)前尚未被納入 COSMIC 癌基因目錄。

最后，腫瘤基因解碼參考 OncoKB 知識(shí)庫（http://oncokb.org/）評(píng)估了已鑒定驅(qū)動(dòng)基因突變的臨床可操作性。結(jié)果顯示，在 OncoKB 注釋的 110 個(gè)變異中，有 17%（19/110）具有可靶向性（OncoKB Level 1–4）。其中大多數(shù)（18/19）為 Level 3B，即在其他腫瘤類型中已被視為標(biāo)準(zhǔn)治療依據(jù)的預(yù)測性生物標(biāo)志物。

共分析了 57 例成年參與者的樣本。獨(dú)立在癌癥基因組圖譜（TCGA）和英格蘭基因組（GEL）TGCT 隊(duì)列中鑒定的點(diǎn)突變和插入/缺失（indel）驅(qū)動(dòng)基因，與注釋的 GISTIC2 局灶拷貝數(shù)變化（focal segments）共同展示。圖中還顯示了在 Memorial Sloan Kettering—Metastatic Events and Tropisms（MSK-MET）TGCT 隊(duì)列中這些驅(qū)動(dòng)基因的存在或缺失情況。

在該隊(duì)列中共發(fā)現(xiàn) 17 個(gè)重復(fù)發(fā)生突變的基因，其中 KIT 是最常發(fā)生改變的基因（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 2）。顏色編碼指示了突變類型或 TGCT 的亞型（見圖例）。在同一個(gè)基因中出現(xiàn)多于一種突變類型（錯(cuò)義、無義或框內(nèi)插入）的樣本被歸類為“多重打擊（Multi Hit）”事件。在同一基因中同時(shí)檢測到驅(qū)動(dòng)突變與擴(kuò)增/缺失的樣本則以兩種顏色重疊顯示。

Amp 表示擴(kuò)增（amplification），Del 表示缺失（deletion），CNA 表示拷貝數(shù)改變（copy number alteration），NSGCT 表示非精原細(xì)胞性生殖細(xì)胞腫瘤。

局灶基因組改變中的癌癥驅(qū)動(dòng)基因

我們使用 Battenberg 算法估計(jì)整個(gè)隊(duì)列的克隆性和亞克隆性拷貝數(shù)變異（CNV）。將 GISTIC2 應(yīng)用于這些拷貝數(shù)譜，我們共識(shí)別出 29 個(gè)在局灶擴(kuò)增或缺失中反復(fù)受影響的基因組區(qū)域。

除了既往確立的復(fù)發(fā)性拷貝數(shù)改變（CNA）之外，包括

• 覆蓋 KRAS (12p) 的染色體臂級(jí)別增益,

• 涉及 KIT 的擴(kuò)增 (4q12；19% 病例) 和 MDS2 的擴(kuò)增 (1p36.32；17% 病例)，

• 覆蓋 DMRT1 (9p24.3；37% 病例) 的缺失（與 TGCT 易感性相關(guān)），

我們還鑒定出 26 個(gè)新增的事件。

盡管 KIT 突變似乎僅限于精原細(xì)胞瘤（seminoma）的一個(gè)亞群，但覆蓋 KIT 的擴(kuò)增在 NSGCT 中也有觀察到（圖 2）。

我們發(fā)現(xiàn)以下區(qū)域發(fā)生了復(fù)發(fā)性擴(kuò)增：

• 1q21.3（14%），覆蓋癌基因 SETDB1；

• 7q11.23（46%），覆蓋 CDK6；

• 22q11.1（25%），覆蓋 DGCR8。

在精原細(xì)胞瘤中，還觀察到局灶缺失涉及 CCNA1（cyclin A1） 和 轉(zhuǎn)錄因子 FOXO1（13q13.3），二者均對(duì)成功的精子發(fā)生至關(guān)重要。

值得注意的是，覆蓋 AFP（4q13.2） 的局灶擴(kuò)增也僅出現(xiàn)在一部分精原細(xì)胞瘤中（8/57）。雖然甲胎蛋白一般作為與 NSGCT 相關(guān)的血清腫瘤標(biāo)志物，但已有報(bào)道指出部分組織學(xué)上純的精原細(xì)胞瘤也會(huì)出現(xiàn) AFP 升高。

多個(gè)復(fù)發(fā)性缺失涉及 WNT 信號(hào)通路相關(guān)基因，包括鈣黏蛋白 CDH1 與 CDH11、CREBBP（16q24.2）和 SMAD4（18q22.2）。

互斥性分析顯示主要驅(qū)動(dòng)事件大多不會(huì)同步出現(xiàn)；然而，我們識(shí)別出的最顯著驅(qū)動(dòng)基因相互作用為協(xié)同事件，包括

• PIK3CA–MCL1 擴(kuò)增,

• RB1–FLI1、RB1–MEN1 和 MAF–SMAD4 缺失（補(bǔ)充圖 5）。

互斥事件包括 KIT–MAF 和 PTMA–MCL1。唯一的染色體內(nèi)配對(duì)事件為并存的 MEN1–FLI1 缺失。

12p 增益與 i12p 的結(jié)構(gòu)特征

TGCT 發(fā)病的主要體細(xì)胞特征是 12p 染色體拷貝數(shù)增益，其典型結(jié)構(gòu)為 等臂染色體 i12p。

我們觀察到 75%（43/57）腫瘤呈現(xiàn)與至少一個(gè) i12p 一致的等位基因拷貝數(shù)模式。其中

• 5/43（12%） 被分類為典型染色體（見補(bǔ)充方法），但具有 12p 臂的復(fù)雜重排。

• 這些復(fù)雜的 i12p 病例均為精原細(xì)胞瘤，且呈現(xiàn) 11q24.3 的復(fù)發(fā)性局灶缺失，涉及 ETS 轉(zhuǎn)錄因子 FLI1。

缺乏 i12p 的腫瘤大多仍為精原細(xì)胞瘤（13/14，93%），其特點(diǎn)是 至少擁有 12p 的四個(gè)拷貝。

僅在 兩個(gè)樣本中觀察到 12q 的雜合性缺失（LOH），提示多數(shù)腫瘤在形成 i12p 之前已發(fā)生

• 染色體 12 的倍增或

• 第二次全基因組加倍（WGD），

這與先前報(bào)道一致。
 

TGCT 中的結(jié)構(gòu)變異熱點(diǎn)

按照 Glodzik 等人描述的方法，我們識(shí)別出 1 個(gè)涉及大規(guī)模串聯(lián)重復(fù)（tandem duplication, TD；>100 kb）的結(jié)構(gòu)變異熱點(diǎn)以及 8 個(gè)缺失熱點(diǎn)。我們?cè)?chr19:55–58 Mb 區(qū)域觀察到一個(gè) TD 熱點(diǎn)，覆蓋組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 GLP。有趣的是，在 C. elegans 中，Notch 受體 glp-1 的功能獲得性突變已被報(bào)道會(huì)導(dǎo)致生殖系腫瘤形成。然而，該熱點(diǎn)并未與任何 GISTIC 定義的局灶擴(kuò)增區(qū)域重疊。

與拷貝數(shù)缺失相關(guān)的缺失熱點(diǎn)包括：

• chr3:60 Mb，覆蓋 FHIT（fragile histidine triad） 基因；

• chr9:7–12 Mb，覆蓋蛋白酪氨酸磷酸酶 PTPRD；

• chr16:78–84 Mb，靶向鈣黏素 13（CDH13）。

我們?cè)谝粋€(gè)腫瘤（GEL-TGCT-0056）中觀察到 染色體碎裂（chromothripsis），這是一個(gè)罕見的、具有體細(xì)胞型惡性轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)移性畸胎瘤病例。在該樣本中，23 個(gè)結(jié)構(gòu)變異在一次災(zāi)難性事件中發(fā)生，影響染色體 7 和 17，包括 PPM1D 的擴(kuò)增。該患者中未檢測到與 Ewing 肉瘤或相關(guān)原始神經(jīng)外胚層腫瘤（PNET）相關(guān)的經(jīng)典易位或基因融合。

染色體外 DNA（ecDNA）上的 KRAS 擴(kuò)增

我們進(jìn)一步利用 GEL 數(shù)據(jù)集探索睪丸癌中染色體外 DNA（ecDNA）的形成特征。ecDNA 在多種癌癥中常與癌基因擴(kuò)增及預(yù)后不良相關(guān)。使用 Amplicon Architect 工具，我們?cè)?TGCT 中檢測并分類了擴(kuò)增結(jié)構(gòu)。

在 85%（46/54） 的 TGCT 樣本中識(shí)別到了擴(kuò)增子（amplicons）。單區(qū)間擴(kuò)增子的大小范圍從 116 kb 到 76 Mb（中位數(shù) 4 Mb），超過 85%（113/130） 的擴(kuò)增子大于 1 Mb。

至少兩個(gè)樣本中觀察到的復(fù)雜重排覆蓋了既往已知 TGCT 癌基因，包括：

• KRAS、MYC、EGFR，
  以及常見致癌通路中的關(guān)鍵基因，如

• WNT 通路（SOX2）

• 受體酪氨酸激酶（RTK）通路（PDGFRA）

• p53 通路抑制因子（CDK4/6、MDM2）。

在循環(huán)型擴(kuò)增結(jié)構(gòu)中（其中一例為 ecDNA），唯一被識(shí)別出的癌基因?yàn)?KRAS，且僅出現(xiàn)在精原細(xì)胞瘤（seminoma）中。具有 斷裂-融合-橋（breakage-fusion-bridge）機(jī)制特征 的擴(kuò)增子也僅在精原細(xì)胞瘤中檢測到。

此外，與 NSGCT 相比，精原細(xì)胞瘤攜帶顯著更多的擴(kuò)增結(jié)構(gòu)（p = 0.018）。
 

完整的突變特征譜（Complete repertoire of mutational signatures）

為了深入理解突變的病因基礎(chǔ)，我們提取了突變特征。在大多數(shù)腫瘤中，單堿基替換（SBS）主要?dú)w屬于 SBS5/SBS40 和 SBS1，這些特征被認(rèn)為源自內(nèi)源性的、類似時(shí)鐘的突變過程。然而，只有 SBS5 和 NpCpG 三核苷酸位點(diǎn)上 C>T 的數(shù)量與年齡相關(guān)（p = 4.3 × 10?? 和 p = 0.02）。攜帶 KIT 突變的精原細(xì)胞瘤（seminoma）的 SBS1 明顯低于野生型精原細(xì)胞瘤（p = 0.0028）以及 NSGCT（p = 5.5 × 10??）。

亞型相關(guān)的 SBS 模式

某些 TGCT 亞型呈現(xiàn)出獨(dú)特的 SBS 特征：

• SBS18（與活性氧 ROS 損傷相關(guān)）在兩個(gè)腫瘤中檢測到，這兩例均為 NSGCT，且含有少量 YST 成分。

  • 在 GEL-TGCT-0038 中，大多數(shù)突變均來自 SBS18。

  • 該特征此前已在多種兒科癌癥、胎盤組織和青春期前/圍青春期 YST 患者中被報(bào)道。

• SBS35（鉑類化療暴露特征）如預(yù)期般在兩例化療后轉(zhuǎn)移灶中檢測到。

• SBS31（另一種鉑類藥物相關(guān)特征）則在一例臨床 I 期精原細(xì)胞瘤中檢測到，該病例在取樣后接受了根治性睪丸切除術(shù)及卡鉑治療。

• SBS32（與硫唑嘌呤 azathioprine 治療相關(guān)，且此前未在 TGCT 中報(bào)道）檢測于 11%（6/57） 的患者中，但這些患者均無此類治療史。

  • 在急性髓系白血病的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，提示除了藥物暴露外，可能存在其他導(dǎo)致 SBS32 的突變機(jī)制。

克隆與亞克隆階段的特征差異

我們觀察到克隆性與亞克隆性突變間的突變特征活性存在差異，總體上亞克隆突變中 SBS5 占比更低（p = 2.2 × 10?¹?）。

插入/缺失（ID）特征

• ID 主要由 ID1 和 ID2 構(gòu)成——二者均與 DNA 復(fù)制過程中的滑移有關(guān)。

• 由不同 DNA 雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生的 ID6 與 ID8 呈互斥現(xiàn)象。

雙堿基替換（DBS）特征

在 TGCT 中檢測到的 DBS 多數(shù)病因不明，例外為：

• DBS2（吸煙相關(guān)），

• DBS5（鉑類化療相關(guān)）。

驅(qū)動(dòng)基因組重排的突變過程

我們進(jìn)一步探索導(dǎo)致基因組重排的突變過程。

首先，使用一個(gè)新的框架對(duì)腫瘤的21 種泛癌拷貝數(shù)特征（CN1–CN21）進(jìn)行分型。
結(jié)果包括：

• CN2（四倍體相關(guān)）為大多數(shù)樣本共有，見于精原細(xì)胞瘤與 NSGCT。

• 多個(gè)腫瘤同時(shí)呈現(xiàn) CN1 與 CN2，提示其呈高倍體或亞四倍體狀態(tài)。

• 檢測到 CN13–CN15 特征，這些特征與特定的數(shù)值型染色體不穩(wěn)定性相關(guān)，涉及整臂或整染色體水平的 LOH。

  • CN13（以總拷貝數(shù) 1 的 LOH 段為主）僅見于 NSGCT。

少部分參與者（3/57，5%）同時(shí)攜帶 CN1、CN13 和 CN15，這些腫瘤具有大量 拷貝數(shù)中性 LOH，并出現(xiàn)于轉(zhuǎn)移樣本或后續(xù)發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)樣本中，提示此特征可能具有臨床意義。

結(jié)構(gòu)變異（SV）特征

我們基于類型與大小對(duì)結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行分型（方法見正文），并使用與其他突變特征相同的統(tǒng)計(jì)框架。檢測到 兩個(gè)結(jié)構(gòu)變異特征（S1、S2），出現(xiàn)在精原細(xì)胞瘤與 NSGCT 中。

• S1 類似參考特征 RefSig R2：以非簇集性易位為特點(diǎn)

• S2 類似 RefSig R5：以不超過 100 kb 的非簇集性缺失為特點(diǎn)

既往研究中：

• RefSig R5 與 BRCA2 突變相關(guān)

• RefSig R2 與 TP53 驅(qū)動(dòng)突變相關(guān)

雖然本隊(duì)列未檢測到 BRCA2 突變，但在 攜帶 BRCA2 缺失的腫瘤中 S2 特征顯著增加（p = 0.001528，Wilcoxon 檢驗(yàn)）。
其他與同源重組修復(fù)缺陷相關(guān)的特征在本隊(duì)列中未檢出（SBS3）或僅見于少數(shù)樣本（ID6/ID8）。因此，目前無法明確 BRCA2 缺失是否對(duì)整體突變特征譜有貢獻(xiàn)。
 

整合基因組復(fù)制的流行率（Prevalence of whole genome duplication）

在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（TGCT）中，全基因組復(fù)制（WGD）幾乎是普遍存在的；近期研究表明這些事件在胚胎發(fā)育早期發(fā)生。
在本研究的 GEL 隊(duì)列中，除 1 例外（56/57），所有腫瘤都顯示發(fā)生了 WGD。

研究團(tuán)隊(duì)使用 MutationTimeR 對(duì)體細(xì)胞突變相對(duì)于拷貝數(shù)擴(kuò)增的時(shí)間進(jìn)行了推斷，并基于復(fù)制前后發(fā)生的“時(shí)鐘式突變”（clock-like mutations）比例來估計(jì) WGD 的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示：

• 中位數(shù)約 9 個(gè)突變 發(fā)生在 WGD 之前（范圍 0–375）。

• 在 7 例腫瘤中未觀察到任何復(fù)制前突變，支持 WGD 極早發(fā)生、很可能在宮內(nèi)期形成（Fig. 3a）。

• 這一現(xiàn)象與大多數(shù)實(shí)體瘤形成鮮明對(duì)比：在其他癌種中，WGD 通常在克隆演化過程中隨機(jī)出現(xiàn)，而非早期事件（Fig. 3b）。

然而，有三例顯示 WGD 相對(duì)于其他樣本發(fā)生得更晚：

• 其中一例為廣泛轉(zhuǎn)移、以胚胎癌（EC）成分為主的 GCT，具有估計(jì) 375 個(gè) WGD 前突變。

• 另兩例均為臨床 I 期精原細(xì)胞瘤（seminoma），并且均為異時(shí)性雙側(cè) TGCT：一名受試者在 100kGP 取樣前 30 年第一次確診，另一名則在取樣后 5 年再次確診。

在這例轉(zhuǎn)移性病例中，既往存在雙側(cè)可復(fù)性睪丸（retractile testis）的病史，但未記錄過雙側(cè) TGCT。近期單細(xì)胞研究指出，新生兒睪丸中可存在少量具原始生殖細(xì)胞（PGCs）特征的 gonadal 細(xì)胞。因此，這些在嬰兒期仍殘留的 PGC 樣細(xì)胞可能經(jīng)歷相同的 WGD 過程。

研究進(jìn)一步利用 PGC 的細(xì)胞分裂突變率估計(jì) WGD 在 PGC 發(fā)育過程中的發(fā)生時(shí)點(diǎn)。剔除晚期 WGD 的病例后，TGCT 的中位 WGD 發(fā)生于 約第 11 次細(xì)胞分裂（范圍 0–71.5）。這進(jìn)一步將 TGCT 的基因組學(xué)起點(diǎn)定位于胚胎發(fā)育時(shí)期。

在發(fā)生 WGD 的腫瘤中，75%（42/56）顯示同步染色體增益（Fig. 3c），與 PCAWG 中 WGD 腫瘤報(bào)告的增益模式整體一致。
另外 21%（12/56）顯示非同步（asynchronous）增益，這些腫瘤均為純精原細(xì)胞瘤或以 EC 或 seminoma 成分為主的 NSGCT，提示不同組織發(fā)生路徑可能具有不同的染色體演化模式。

此外：

• CN2（四倍體相關(guān)拷貝數(shù)特征）在同步增益樣本中比例更高（P=0.029）。

• CN14 在非同步增益的基因組中比例更高（P=0.006）。

TGCT 中基因組復(fù)制與驅(qū)動(dòng)事件的相對(duì)時(shí)間關(guān)系

研究使用置換方法識(shí)別在 TGCT、精原細(xì)胞瘤以及 NSGCT 中具有顯著富集或缺失的 CNAs，并使用概率模型重建了這些趨異事件的獲得順序，包括 WGD、富集的拷貝數(shù)改變，以及候選驅(qū)動(dòng)突變（Fig. 4）。

富集的拷貝數(shù)增益事件

涉及多種已知癌基因和 TGCT 驅(qū)動(dòng)基因，例如：

• MYC（8q11-q24）

• EGFR（7p11.2）

• BRAF（7q34）

富集的 LOH（雜合性缺失）事件

涉及多個(gè)腫瘤抑制基因，例如：

• APC（5q22.2）

• ATM（11q22.3）

• CDX2（13q12.2）

未發(fā)現(xiàn)顯著富集的純合缺失事件。

同時(shí)，也鑒定到顯著負(fù)富集的 CNAs，意味著這些事件可能對(duì) TGCT 無助，或在 WGD 的背景下不適宜發(fā)生。

事件順序

• 與 WGD 發(fā)育時(shí)間分析一致，四倍化（WGD）是最早事件。

• 隨后是 12p 增益，覆蓋 KRAS，這可能提示其在成年 TGCT 的腫瘤起始中具有作用。

利用 AmplificationTimeR，研究進(jìn)一步對(duì)染色體 12 的特異性高拷貝增益進(jìn)行了更精確的時(shí)間推斷：

• 大多數(shù)樣本支持 12p 增益在 WGD 之后。

• 但也有部分樣本顯示 12p 增益發(fā)生在 WGD 之前，提示在某些病例中它可能是最早的遺傳事件。

組織亞型差異

• 大多數(shù) WGD 后的早期事件是染色體拷貝數(shù)增益，并且在 TGCT 中廣泛共享。

• 更晚的富集事件則趨向亞型特異：

  • 例如 NSGCT 特有的 12q11 增益（覆蓋 KIF21A）。

• 精原細(xì)胞瘤中唯一特異富集的 CNA 是 BRCA2 的 LOH（chr13:18–114 Mb）。

  • 雖未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，但多數(shù)（12/14；86%）屬于 年輕發(fā)病（<40 歲）。

年輕精原細(xì)胞瘤中還觀察到其他特異富集的 CNAs，例如 chr8:45–129 Mb 和 chr7:60–159 Mb（Fig. 4c）。

克隆結(jié)構(gòu)與驅(qū)動(dòng)突變的時(shí)間關(guān)系

通過 Dirichlet 過程算法對(duì) SNV 和 indel 按癌細(xì)胞比例進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示：

• 不同患者間 SNV、indel 或 CNA 的亞克隆比例與腫瘤分期或類型無顯著關(guān)聯(lián)。

• 一例純 seminoma 的多部位取樣分析顯示患者體內(nèi)腫瘤異質(zhì)性有限。

在所有亞型中，驅(qū)動(dòng)基因突變（包括 KIT、KRAS、NRAS 等）均為較晚事件，發(fā)生在 WGD 之后，并且晚于對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)增益或其他 CNA（Fig. 4b, c）。

此外：

• 帶有 KRAS 或 KMT2C 驅(qū)動(dòng)突變的患者通常具有更高的診斷年齡。
   

  HLA 丟失在精原細(xì)胞瘤中更常見（HLA loss enriched in seminomas）

  在 60 例腫瘤中，沒有任何樣本攜帶人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因的非同義突變（方法）。然而，使用 LOHHLA 算法在 6 例腫瘤中檢測到 HLA 位點(diǎn)的雜合性缺失（LOH），即父源或母源等位基因的丟失（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 8）。

  在其中兩例精原細(xì)胞瘤（seminoma）中，HLA LOH 僅影響一個(gè) I 類基因；在另外三例中，HLA-A 和 HLA-C 基因受到影響。還有一例中，HLA LOH 可能影響全部三個(gè) HLA 基因，該例是唯一受影響的 NSGCT。

  在 GEL-TGCT-0053（一例化療后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的樣本中，檢測到 HLA-A 和 HLA-B 的 LOH；雖然由于檢測到兩個(gè)高度相似的 HLA-C 單倍型（C07:02 和 C07:01），無法確證 HLA-C 的 LOH，但基因排序表明其很可能也發(fā)生了 HLA-C 的丟失。

  我們未觀察到 HLA 純合性（方法）與診斷年齡、臨床分期或病理分期之間存在顯著關(guān)聯(lián)。

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  等位基因不平衡（但未形成 LOH）

  在另一 17 例樣本中觀察到未伴隨 LOH 的等位基因不平衡，即由于 HLA 位點(diǎn)不等量的拷貝增益或 LOH 未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性導(dǎo)致的 HLA 不平衡，分布于精原細(xì)胞瘤與 NSGCT。

  • 在這些病例中，多數(shù)為精原細(xì)胞瘤（9/17；53%）。

  • 其余多數(shù)病例的主要組織學(xué)類型為胚胎癌（EC）（6/17；35%）。

  這提示 TGCT 中可能存在亞型特異的免疫破壞機(jī)制。

  未觀察到 HLA 或 B2M 突變，這類突變可影響新抗原與 MHC 的結(jié)合（方法）。在抗原呈遞及加工相關(guān)基因中篩查體細(xì)胞突變（方法）時(shí)，發(fā)現(xiàn)一例攜帶 HLA LOH 的精原細(xì)胞瘤同時(shí)獲得了蛋白酶體調(diào)控因子 PSME4 的突變，該基因在免疫蛋白酶體活性與免疫肽組多樣性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

  總體而言，這些發(fā)現(xiàn)提示，雖然 HLA 突變并非 TGCT 中主要的免疫逃逸機(jī)制，但 HLA LOH 可能代表一種免疫破壞或逃逸的途徑，主要發(fā)生在部分精原細(xì)胞瘤中，仍需進(jìn)一步研究。

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  新抗原負(fù)荷及 HLA LOH 對(duì)其影響

  TGCT 樣本中位擁有 10 個(gè)新抗原突變，主要來源于 SNV（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 8）。
  我們未發(fā)現(xiàn) HLA LOH、HLA 不平衡或完整 HLA 位點(diǎn)之間的新抗原負(fù)荷存在顯著差異。

  進(jìn)一步分析具有 HLA LOH 的腫瘤是否受到 LOH 事件影響其新抗原景觀（補(bǔ)充圖 19）。研究團(tuán)隊(duì)比較了：

  • 預(yù)測能結(jié)合被丟失的等位基因的抗原肽數(shù)量
    vs.

  • 預(yù)測能結(jié)合保留等位基因的抗原肽數(shù)量。

  總體上未觀察到顯著差異，但有 3/6 樣本（GEL-TGCT-0007、GEL-TGCT-0018、GEL-TGCT-0050）呈現(xiàn)趨勢：與丟失等位基因相關(guān)的抗原肽數(shù)量更多。

  另有 2/6 樣本表現(xiàn)相反趨勢，但差異較小。

  這些結(jié)果可能表明：

  • 在部分精原細(xì)胞瘤中，HLA LOH 可提供實(shí)際的免疫選擇壓力逃逸；

  • 而在其他病例中，免疫選擇壓力可能很弱，或 HLA LOH 只是其他非遺傳性免疫逃逸機(jī)制的繼發(fā)事件。
    
     

    佳學(xué)基因評(píng)述（Discussion）

    據(jù)我們所知，本研究提供了迄今為止規(guī)模最大的成人 TGCT（睪丸生殖細(xì)胞腫瘤）全基因組分析。本研究將已發(fā)表的全基因組數(shù)量擴(kuò)大了近十倍，更加明確了分子亞型的基因組基礎(chǔ)，并刻畫了腫瘤的典型演化軌跡。

    我們?yōu)?17 個(gè)候選驅(qū)動(dòng)基因提供了支持證據(jù)，其中包括亞型特異性的驅(qū)動(dòng)基因。此外，我們鑒定到 PTMA 的一處潛在喪失功能型驅(qū)動(dòng)突變，而該基因目前未被 OncoKB 或 COSMIC 癌癥基因名錄收錄。既往研究提示 PTMA 的同源基因 PTMS（parathymosin）可能與 GCT 的表觀遺傳重塑有關(guān)。那些僅在單一 TGCT 隊(duì)列中被鑒定出的潛在驅(qū)動(dòng)基因，如 GEL 隊(duì)列中的 KLF4 或 TCGA 中的 FAT4，可能代表罕見或低頻率的驅(qū)動(dòng)事件。一項(xiàng)關(guān)于兒童和青少年 GCT 的最新研究報(bào)告稱，F(xiàn)AT 家族基因僅在非精原細(xì)胞瘤亞型中發(fā)生突變。本研究中檢測到的涉及鈣黏蛋白基因的復(fù)發(fā)性缺失及結(jié)構(gòu)變異熱點(diǎn)，支持這些蛋白在 TGCT 致癌及進(jìn)展中可能具有重要作用。支持細(xì)胞–生殖細(xì)胞黏附對(duì)于精子發(fā)生至關(guān)重要，而鈣黏蛋白是睪丸中細(xì)胞間黏附的重要介導(dǎo)者。

    我們觀察到所有參與者中 SBS1 的負(fù)荷均低于 SBS5，這可能與隊(duì)列的年齡分布有關(guān)，且部分病例中名義上與“分子時(shí)鐘”相關(guān)的 SBS1 完全缺失。最新觀察支持以下假設(shè)：正常生精小管中較低的 SBS1 負(fù)荷，可能由于精原干細(xì)胞相比體細(xì)胞干細(xì)胞具有更低的分裂速率，同時(shí) SBS1 與 SBS5 的產(chǎn)生速率是獨(dú)立調(diào)控的。此前有觀點(diǎn)認(rèn)為 SBS1 突變可能在 DNA 復(fù)制時(shí)、也就是細(xì)胞有絲分裂時(shí)產(chǎn)生。KIT 突變的精原細(xì)胞瘤中 SBS1 的貢獻(xiàn)減少，可能表明這些細(xì)胞處于或曾經(jīng)處于長期的有絲分裂停滯狀態(tài)。

    此外，我們鑒定出六個(gè)散發(fā)的 SBS 突變特征。值得注意的是，與長期硫唑嘌呤暴露相關(guān)的 SBS32 在約 10% 的參與者中被檢測到，盡管沒有記錄到此類治療史，提示可能存在其他可導(dǎo)致 SBS32 突變的暴露因素。惡性 GCT 的胎兒起源提示這些暴露甚至可能發(fā)生于子宮內(nèi)。另一種可能性是，不同年齡的暴露或個(gè)體對(duì)突變損傷的易感性差異，也可能解釋精原細(xì)胞瘤觀察到的雙峰發(fā)病年齡分布?；チ鰜喰褪且粋€(gè)終末分化的組織，通常對(duì)化療不敏感。本研究報(bào)道的化療后畸胎瘤中明顯缺乏與鉑類藥物暴露相關(guān)的 SBS31 和 SBS35，這提示至少部分原因可能是未分化細(xì)胞能夠抵抗化療通常引起的特定突變損傷。我們?cè)诔扇?TGCT 中報(bào)道到 SBS18，且僅出現(xiàn)在 NSGCT 中，可能對(duì)應(yīng)于發(fā)育早期由內(nèi)源性 ROS 機(jī)制誘導(dǎo)的損傷。突變特征演化分析提示這些過程在 NSGCT 的發(fā)展和進(jìn)展中保持活躍。重要的是，TGCT 中仍有相當(dāng)比例的突變特征來源未知，提示仍存在未被識(shí)別的突變過程。

    在精原細(xì)胞瘤中，低水平的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）與較差的患者預(yù)后相關(guān)，如更高的臨床分期及增加的復(fù)發(fā)率。本研究發(fā)現(xiàn) HLA LOH 幾乎僅見于精原細(xì)胞瘤，且可能導(dǎo)致抗原肽呈遞減少，這提示一種可能的基因組機(jī)制，解釋 TILs 低的精原細(xì)胞瘤亞群。此外，一項(xiàng)近期研究報(bào)告 GCT 中 HLA-I LOH 的發(fā)生率為 16.7%，與我們的結(jié)果基本一致。

    TGCT 中基因組事件的時(shí)間順序與大多數(shù)腫瘤在性腺發(fā)育途徑中的起源一致。與 TGCT 經(jīng)典模型一致，WGD（全基因組加倍）發(fā)生在最早階段，可能源于有絲分裂后期的著絲粒分裂錯(cuò)誤，并通常先于 12p 的增益。盡管 TGCT 的其他基本生物學(xué)異常已在原位生殖細(xì)胞腫瘤（GCNIS）中顯現(xiàn)，但 WGD 在這些前驅(qū)病變中是否同樣頻繁，或是否在無臨床表現(xiàn)的正常生殖細(xì)胞中存在，仍有待確定。概率排序同樣支持以下觀點(diǎn)：在腫瘤細(xì)胞早期四倍化之后的染色體獲得與丟失并非隨機(jī)，而是在典型 TGCT 發(fā)育過程中有特定事件被偏好或被抑制。最近對(duì)卵巢腺癌的分析提示，盡管 WGD 通常在克隆演化早期發(fā)生，但可貫穿女性生殖生命周期出現(xiàn)。然而，在男性生殖組織中，此類事件可能僅限于早期生命階段。本研究中鑒定出的少數(shù)較晚發(fā)生 WGD 的腫瘤提示 TGCT 存在少見的病因，這些情況需要在更大隊(duì)列中進(jìn)一步研究。

    本研究的局限性包括相對(duì)較小的樣本量，以及隊(duì)列的臨床同質(zhì)性（早期精原細(xì)胞瘤患者比例較高），導(dǎo)致某些亞群分析的樣本量有限。更大規(guī)模的靶向研究將有助于分析更罕見的 TGCT 亞型、更具侵襲性的疾病類型以及生存結(jié)局較差的個(gè)體。另一個(gè)局限是我們僅考慮了 DNA 這一單一數(shù)據(jù)模態(tài)。盡管我們確定了 TGCT 發(fā)病中的潛在驅(qū)動(dòng)因素，但在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)將提高對(duì)其可靠性的信心。對(duì)多模態(tài)數(shù)據(jù)（如 RNA、蛋白質(zhì)、DNA 可及性）的分析對(duì)于更深入理解 TGCT 的起始與進(jìn)展機(jī)制至關(guān)重要。此外，我們的分析未考慮種系變異的潛在致病性，未來研究應(yīng)予以關(guān)注。盡管存在這些局限性，本研究揭示了驅(qū)動(dòng) TGCT 腫瘤發(fā)生與進(jìn)展的多樣基因組過程，并強(qiáng)調(diào)了可能促進(jìn)特定 TGCT 亞型免疫逃逸的重要基因組改變。